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寫在前面：以前覺得我需要花很多時間去學數據分析，去學統計，學制圖，現在慢慢覺得文獻閱讀才是整個學習中最重要的部分。統計分析跟制圖，在了解了方法后在很短時間內就能掌握，但是知識體系的搭建，是需要很長的時間去積累和培養的。一個好的idea，一篇具有創新性的文章，往往是建立在閱讀大量文獻的基礎上。閱讀不同的文獻，從不同角度思考問題，培養自己的批判性思維方式，構建屬于自己的知識體系，需要一個很長的學習過程。這是一篇極具批判性的文章，近年來從實地調查中公布的基于序列的原生生物物種豐富度呈指數級增長，引發了一個問題，即我們是否已經超越了對物種水平多樣性的表征，并開始揭示種內多樣性。這個問題的答案似乎是肯定的，至少對于某些原生生物譜系而言是這樣。記錄這種微多樣性的必要性可能是合理的，但對原生動物學家來說，認識和承認這種可能性及其后果是很重要的。

Trends in Microbiology, March 2019, Vol. 27, No. 3 https://doi.org/10.1016/j.tim.2018.10.009

我們是否高估了自然界中原生生物的多樣性？

SUMMARY:

記錄單細胞真核生物（原生生物）的巨大多樣性對生態學家來說是一項艱巨的挑戰。這些物種最初是由形態學標準定義的，但形態物種概念的缺點，以及令人眼花繚亂的大小和細胞屬性，使得構建一個對生態學家有用的分類學幾乎不可能。因此，生理和遺傳信息已被整合解決這些缺點，并開發統一分類法的框架。特別是 DNA 序列信息，徹底改變了原生生物多樣性的研究。然而，近年來從實地調查中公布的基于序列的原生生物物種豐富度呈指數級增長，引發了一個問題，即我們是否已經超越了對物種水平多樣性的表征，并開始揭示種內多樣性。這個問題的答案似乎是肯定的，至少對于某些原生生物譜系而言是這樣。記錄這種微多樣性的必要性可能是合理的，但對原生動物學家來說，認識和承認這種可能性及其后果是很重要的。

Highlights

直到最近，使用傳統的基于形態學的分類法才能確定自然群落中原生生物物種豐富度的全部范圍，但目標基因的高通量測序 (HTS) 揭示了前所未有和意想不到的物種豐富度。

矛盾的是，最近對原生生物操作分類單元 (OTU) 數量的一些估計現在接近小樣本中存在的個體原生生物的總數。許多原生生物學家在尋求充分記錄自然微生物群落多樣性的過程中似乎沒有意識到這一悖論。

種內變異可能是許多原生生物形態種的行為和生理學的重要組成部分。

需要一條區分種間序列變異性的前進道路，包括對序列的嚴格質量控制和 OTU 調用方法的標準化。

Protists, Their Diversity, and Why They Are Important

單細胞真核生物（原生生物）陸地和水生環境中的許多基本生態和生物地球化學活動至關重要，包括光合作用、營養耦合、元素轉化、分解和疾病。光合原生生物是世界各地重要漁業食物鏈的基礎，而異養生物對于水、沉積物和土壤中營養元素的分解和再礦化至關重要。表征原生生物多樣性對于理解它們在現代（和未來）生態系統中的生物地理學、生態學和生物地球化學意義至關重要。 此外，許多物種的化石遺骸（例如，測試、尺度等）已被用作重建古代海洋和湖泊氣候條件的工具。

原生生物在真核生命樹中構成了令人難以置信的形態和功能多樣性，其中還包含動物、植物和真菌，盡管與單細胞生物相比，后者形成的分支相當小。它們存在于地球上幾乎所有孕育生命的生態系統中，有數千種被描述的物種，包括許多化石“物種”。雖然大多數原生生物學家認為大量原生生物物種仍有待發現和描述，但有些人認為大多數主要“類型”的原生生物已經被記錄在案。這些不同的觀點揭示了定義原生生物物種的根本爭議。

A Complicated History of Defifining Protistan Species

自從大約三個半世紀前Antonie van Leeuwenhoek發現原生生物以來，描述自然界中原生生物的多樣性一直是一項艱巨的任務，今天仍然是一項艱巨的挑戰。 最近的一項研究估計，我們星球上的物種豐富度超過1萬億種，當然，其中大部分是微生物物種，包括未知但很大比例的原生生物。這些估計的基礎取決于將“遺傳”（即基于DNA序列的）多樣性與“物種”多樣性等同起來。這種解釋在細菌和古細菌中已經很普遍，但直到最近才被廣泛應用于原生生物。基于序列的物種概念的采用較慢，部分原因是原生生物物種傳統上是根據形態特征來定義的。

形態學仍然是描述原生生物物種的“黃金標準”，但將形態物種概念應用于原生生物多樣性研究存在多個問題。含義模糊的物種的身體形態看起來非常相似（即，根據形態無法區分）但具有不同的生理機能（即，它們構成基于生態物種概念的不同物種）。經典的例子包括一些微小的葉綠素和金藻，它們在常規光學顯微鏡下幾乎沒有明顯的形態特征，但具有不同的營養吸收能力、光照需求或生長速率。同樣，具有無定形形態特征的物種，例如致病性變形蟲，很難通過形態來區分，因此我們不得不依賴其他屬性（即基因序列或臨床表現）（圖 1）。包含有性分離交配類型的難以區分的原生生物形態也混淆了原生生物形態物種的概念。“梨形四膜蟲復合體”中的纖毛蟲包括幾種不相容的交配類型，根據生物物種概念將不相容的類型限定為物種（圖 1）。此外，一些生活史復雜的原生生物在不同的生命階段會表現出不同的形態，從而導致對同義物種的描述。原生生物形態種概念的這些許多缺點使得表征自然界中的物種多樣性變得非常困難。

圖1. 原生生物的問題物種概念。傳統上對原生物種的定義是形態學的（它仍然是該領域的黃金標準；左上角）。然而，許多類群，尤其是微小的分類群缺乏形態學細節，導致應用綜合物種概念，該概念結合了生物物種概念（上、右）、生態物種概念（左下）和最近的一些基于“遺傳相似性”和系統發育親緣關系方面的概念（右下）。這些不同類型的信息現在被結合起來產生一個綜合的物種概念（中央框）。后者的努力激發了對原生生物分類群進行條形碼的巨大努力，從而能夠研究原生生物的多樣性、分布、豐度和活動。(A) 從南極洲羅斯海的多年冰中收集到的硅藻組合（標記條 = 100 毫米）。 (B) 減數分裂后和核交換前的一對共軛四膜蟲細胞。細胞核呈綠色（Sytox），纖毛蟲呈藍色（實驗室制造的抗體），皮層呈洋紅色（抗血清）；由 Eric Cole（美國明尼蘇達州圣奧拉夫學院）提供，改編自 Turkewitz 等人。 (C) 交配四膜蟲；康奈爾大學資產項目的電子顯微照片；由 Quirk提供。(D) 棘阿米巴感染的眼睛顯示角膜損傷和視力喪失；改編自 Siddiqui 和 Khan。(E) 荷蘭淡水棘阿米巴的光學顯微照片；圖片由Ferry Siemensma提供。 (F) Novistrombidium testaceum的掃描電子（左）和直接干涉對比（右）顯微照片（標記條 = 10 毫米）；改編自Modeo等人的圖像。

對于試圖使用形態種概念描述自然群落中原生生物多樣性的原生生物學家來說，面臨的一個實際但非常重要的問題是，為了識別所有物種，必須采用大量的協議和分類學方案。由于原生生物在大小、豐度和分類學特征上的巨大差異，基于形態學的全面分類方法幾乎是不可能的。因此，生態學家特別轉向 DNA 序列信息來開發一種可行的分類方法來評估原生生物多樣性，但仍然允許整合多個物種概念以產生整合一系列信息的物種描述（圖 1 ）。

The Double-edged Sword of Genetically Defined Protistan Species

DNA序列已成為生物學家的信息寶庫。序列數據已成為解決以前與真核生物進化有關的頑固問題的核心，極大地改變了我們在過去15年中對真核生物樹結構的看法。使用基因組和轉錄組學方法對自由生活的原生生物的生理能力和適應性進行的基于基因的研究已經開始產生關于原生生物如何感知和響應其化學、物理和生物環境變化的基本信息。

與本文相關的是，對來自自然生態系統的樣本進行的基因調查在我們研究和解釋原生生物物種豐富度的方式方面取得了重大進展。通過對水、沉積物和土壤的序列調查，利用傳統的顯微鏡和培養方法發現了以前未被記錄的原生生物譜系，包括有孔蟲、海洋原生藻、寄生鞭毛藻和頂復體之間的新多樣性。遺傳方法還揭示了在大多數自然生態系統中，原生生物物種的豐富程度令人難以置信，包括大量物種以極低的豐度存在(“稀有原生生物生物圈”)，這些物種可能通過在微生物群落中提供生態冗余，在維持生態系統穩定方面發揮著作用。

近年來，原生生物多樣性的遺傳分析在生態學中得到了廣泛的應用和認可。5-10年前采用DNA片段分析或基因克隆和測序的研究已經讓位于高通量測序(HTS)，它可以快速且廉價地生成大量短序列讀數。具有高度相似性的DNA序列通常會聚合到操作分類單元(OTU)中。大多數用于評估原生生物物種豐富度的方法目前都集中在核糖體RNA基因上，特別是小亞基核糖體RNA基因（ssu rDNA或18S），盡管條形碼項目也檢查了其他基因和內部轉錄間隔(ITS)區域。

這項工作中的一個默認假設是，可以將序列信息組織成 OTU，這些 OTU 大致對應于原生生物之間的物種級別差異。可以肯定的是，微生物真核生物的分子分類將具有顯著的好處，特別是對于努力應對自然生態系統多樣性廣度的生態學家而言。不幸的是，基于所有原生生物群的序列相似性/差異性的“物種”的明確或一致的劃分很難建立，這無疑是由于在短序列中所包含的有限信息，以及原體系中標記基因的進化變化率的差異所造成的。從rDNA序列中形成蛋白酶(和細菌)OTU時，通常采用97-99%的序列相似性值，但為了避免由于測序和其他錯誤造成OTU數量的人為膨脹，有時也會采用95%的序列相似性值。對序列數據進行分組的兩種基本方法是:從頭聚類和將序列與現有數據庫對齊。

這些快速發展的測序技術繼續揭示原生生物中越來越多的物種豐富度，遠遠超過以前描述或預期的傳統方法。例如，Finlayet等為自由生活的纖毛蟲形態的全球物種豐富度提出了一個適中的數字(000)，而HTS方法通常檢測到的OTUs比形態物種多得多。這一發現并不令人驚訝，因為已經確定基于序列的纖毛蟲的身份不一定與形態種評估一致，并且 HTS 可能檢測到存在的分類群，其豐度可能無法通過顯微鏡檢測。 然而，這些估計的差異之大令人擔憂。

此外，遺傳方法實際上低估了某些原生生物群體或譜系的物種豐富度，因此，傳統方法與基于序列的方法之間的差距將隨著HTS的發展而進一步擴大。由于一些常用引物與標記基因的匹配性較差，或者特別長的序列長度阻礙了PCR擴增，一些變形蟲、根瘤蟲、挖掘蟲和異型變形蟲在18S序列多樣性實地調查中代表性較差。這些缺點導致使用多重方法或引物修飾來更好地評估樣本中的序列多樣性（以及原生生物多樣性），或使用群特異性引物來估計總原生生物多樣性的能力有限，但可能會更好地評估特定群體內的多樣性。然而，其結果是，在引物選擇、擴增協議和測序的細節上的差異，可能會產生基于DNA序列的不同物種豐富度估計，即使來自同一樣本(在[48]發表的補充信息中提供了一個從單個樣本集產生的可變性的例子)。

盡管存在這些警告，但 HTS 已經很容易被生態學家采用，因為它使科學家能夠在雄心勃勃的時間和空間尺度上進行調查。 目前的方法導致了“揭示更多多樣性更好”的口頭禪，但不清楚序列多樣性是揭示物種水平還是種內多樣性（微多樣性）。在這方面，觸生藻是一個特別有趣的群體，它們的18S基因顯示出極端的微多樣性。盡管有證據表明測序可以提供對豐富度的估計，有時比對著名分類群（如纖毛蟲）的形態學研究揭示的物種豐富度高出幾個數量級，但關于原生生物高“物種”豐富度的報告現在在文獻中很常見。

細菌生態學家在細菌微多樣性的表征方面取得了快速進展，并且基于基因的細菌物種豐富度的非常高的估計很常見。他們的方法是明智的，因為(i)許多，也許是大多數，自由生活的分類群仍然無法培養，并且(ii)傳統的細菌分類學主要基于生理學。基因序列有助于提供區分細菌“類型”的遺傳特征，即表現出被認為重要的生理差異的形式。Sogin等人研究了海洋中的細菌物種豐富度，最早應用基于HTS基因的、培養無關的方法來估計微生物多樣性。作者報告說，在相對較小體積的水中，細菌物種豐富度 (OTU) 估計值大于10,000。 這篇開創性的論文展示了遺傳方法揭示大量細菌多樣性的潛力。

目前尚不清楚原生生物學家從揭示自然界中越來越多的序列多樣性的努力中獲得了什么（？？？）。最重要的是，我們現在認為巨大的物種豐富度“更接近事實”，但序列多樣性與生態或形態多樣性之間的關系仍然不明確。最近的研究記錄了在相對較小體積的水、沉積物、土壤或其他環境中存在的數千種原生生物“分類群”。在如此小的樣本中找到找到這種程度的物種豐富度是否現實?有人認為，我們看到的大部分遺傳多樣性僅代表中性突變，即不重要的序列變異。當然，這在序列比較的某個層面上一定是正確的，因為我們很清楚，通過足夠的 DNA 測序，幾乎可以區分地球上的每個人（但如果應用生物物種概念，我們顯然是一個物種）。以此類推，原生生物生態學家似乎已經到了這樣一個地步，我們已經擺脫了無法使用傳統方法對物種豐富度進行分類的問題，以面對將無信息序列差異（中性突變）與信息序列差異區分開來的艱巨任務，后者是那些與我們認為足以賦予獨特科學名稱的原生生物特征相對應的差異（例如，形態學、生理學或交配類型的差異）。

Objectives for Assessing Protistan Species Diversity in the Age of HTS

幾個世紀以來，原生生物學家一直在努力嘗試使用形態學和生理學標準來記錄自然生態系統中單細胞真核生物的多樣性，但收效甚微。鑒于目前和新興的測序能力，現在和未來，原生生物生態學家面臨的任務將集中在理解原生生物可用的巨大DNA序列數據集上，并將這些信息與傳統識別相結合（圖 1）。在某些情況下，這可能相當于在傳統定義的原生生物分類群中接受相當大的序列變異性（例如，95%），而在其他情況下，實際上可能需要更高的分辨率。在所有情況下，該方法都取決于分類單元和目標。

Define and Measure the ‘Appropriate’ Level of Sequence Diversity

我們現在顯然擁有評估原生生物物種豐富度的潛力（有些人可能會爭論現實情況），這遠遠超出了使用現代遺傳方法的物種水平差異，并在此過程中產生了大量沒有實際意義的信息（即生態）價值。據估計，地球上有超過1030種微生物。作為生態學家，我們的目標不應該只是無休止地收集序列數據并將其拆分為無數沒有生態背景或有用性的OTUs。一些研究人員似乎已經忽視了生態環境的必要性，因為他們熱衷于表征越來越多的遺傳多樣性。值得注意的是，我們目前可以定義(沒有遺傳方法)的原生生物的形式和功能的多樣性已經壓倒了全球生物地球化學模型師。更多的多樣性并不一定更好。我們是否應該繼續表征越來越多的遺傳多樣性，因為我們可以這樣做？

這個問題沒有簡單的答案，因為如果它為識別重要能力提供了額外的標準，那么可以有充分的理由來表征遺傳微多樣性（即形態種內的種內序列變異）。例如，Martens等注意到在 68 種分離的甲藻亞歷山大藻菌株中產生的石房蛤毒素和螺亞胺毒素的不同類似物和數量。這種甲藻毒素產生的差異超越了形態種的概念。這些A. ostenfeldii菌株現在應該被描述為許多不同的物種還是被接受為單一物種內的變體，這是分類學家爭論的主題。將每個菌株定義為不同的物種將違背長期以來的共識，即所有種群和物種都表現出一定程度的生理變異性，盡管從人類健康的角度來看，研究它們的遺傳微多樣性可能會揭示毒素產生的關鍵遺傳標記(因此對生態學家和毒理學家非常有用)。

人們接受了這些令人煩惱的復雜情況，但可以合理地問，在對原生生物物種豐富度的遺傳評估中，我們是否已經從“沒有看到一切”迅速發展到“看到太多”。矛盾的是，最近對原生生物 OTUs 數量的一些估計現在接近于在類似大小的樣本中通過顯微鏡觀察和計數的單個原生生物細胞的總數，但從這些相同的數據集構建的 OTUs 稀疏曲線表明還有更多的 OTUs 被檢測到。這些發現意味著我們正在迅速擺脫無法“看到”天然原生生物群落物種豐富度的地步，轉向表征物種內應變水平差異（即微多樣性）的地步。生態學家利用序列信息的關鍵是建立適合他們科學問題或目標的豐富度水平。

Improve Criteria for Forming Protistan OTUs

原生生物學家目前用于形成原生生物 OTUs 的標準一直是一個不斷變化的目標。自從這些方法首次出現以來，生成OTUs的不一致阻礙了研究之間對原生生物豐富度估計的比較。某些數據集（例如，在實驗室或工作組內）可能存在內部一致性，但目前形成OTU的方法在很多方面有所不同，包括：采樣/過濾、模板存儲、提取方案、基因目標/區域、引物選擇和擴增方案、文庫制備、測序平臺、錯誤過濾和嵌合體檢查，以及OTU調用參數。為了促進對原生生物物種豐富度和物種分布的全球（或局部）評估，非常需要一致性。與這一目標直接相關的是，序列信息將繼續快速擴展，揭示原生生物群落內更多的遺傳多樣性。需要進一步的研究來區分各種原生生物群的種間序列變異性和種內序列變異性，包括對序列的嚴格質量控制和一定程度的OTU調用標準化。

幸運的是，用于形成和命名OTUs以及比較不同數據集的集中式數據庫和標準化方法開始解決原生生物多樣性研究之間的不可比性問題。去噪和嵌合體檢測的改進、形成 OTUs 的聚類方法以及用于估計豐富度的進化模型和多樣性指數的評估繼續快速出現在文獻中。模擬群落的使用，定義明確的物種組合，可用于審查HTS應用，然后可應用于微生物真核生物的自然組合，也將改善我們對這些強大但通常知之甚少的方法的使用。此外，許多研究人員現在承認OTUs調用的缺點（特別是缺乏一致性/可比性），并且已經提出了替代方法。擴增子序列變異(ASV)和寡核苷酸分型為檢查基于序列的多樣性提供了替代方法，這些方法可能會產生在研究之間更具可比性的結果，但似乎產生的生態模式與OTUs產生的類似。我們應該鼓勵這種關于序列多樣性的新觀點，并努力在原生生物形態學和生理學的背景下理解它們的含義。

Concluding Remarks

生態學家是否應該繼續使用 DNA 序列探索超越物種水平的原生生物多樣性的深度？這個問題的答案是肯定的，但是這項工作應該在充分承認和公開的情況下進行。現在有越來越多的信息表明，菌株間的變異性是許多原生生物形態種生態學的重要組成部分，保證了嘗試解決其中包含的重要生理差異的遺傳特征。生態學家必須對原生生物的物種概念采取更細致（也更復雜）的觀點（見未決問題）。相反，如果DNA序列多樣性不能通過與形態、功能、次生代謝產物、行為、交配類型或其他一些被認為重要的特征的差異相關的標準來區分原生生物“類型”，那么DNA序列多樣性就毫無意義。簡單地定義越來越多的物種豐富度本身不應該成為我們在原生生物生態學中的分子方法的目標。應該定義有意義的多樣性。